Introducción
A nivel mundial se ha reportado resistencia a los tres grupos de AH comúnmente utilizados(1). De manera similar, la resistencia a los AH derivados del aminoacetonitrilo (monepantel) se desarrolló entre tres y cuatro años después de su introducción al mercado2.
Haemonchus contortus, un nematodo hematófago, es uno de los parásitos más patógenos ya que consume 0.08 ml de sangre por día en el abomaso, lo que resulta en anemia severa e hipoalbuminemia, pérdida de peso y diarrea3. Los extractos de las plantas como Moringa oleífera contienen metabolitos secundarios antiparasitarios, especialmente taninos, por lo que han recibido recientemente una atención significativa y se han evaluado para contrarrestar los parásitos4. Numerosos artículos científicos describen la actividad antihelmíntica de los extractos de plantas y sus fracciones contra H. contortus5,6,7 con resultados positivos. Compuestos como taninos8, flavonoides9, aceites esenciales10, fenilpropanoides11 y alcaloides12 han mostrado propiedades antihelmínticas.
M. oleífera, conocida comúnmente como moringa, pertenece a la familia Moringaceae cuya característica es la capacidad de adaptación a diversas condiciones edafoclimáticas. Su valor nutricional y altos rendimientos de biomasa la convierten en un recurso fitogenético y alimentario debido a la cantidad de proteína total de 25.50 % grasas de 7.4 %, fibra detergente neutro (FDN) 10.35 % y FDA (fibra detergente ácido) de 7.36 %. Además, presenta un 70.5 % de digestibilidad aparente de materia seca y 65.5 % de digestibilidad aparente de proteína13 además de su alto rendimiento de 1,912 kg ha-114. Su valor nutricional y altos rendimientos lo convierten en un recurso filogenético importante para los sistemas de producción de pequeños rumiantes15. M. oleífera se utiliza en la nutrición humana y animal, así como en la medicina tradicional porque contiene compuestos bioactivos en sus partes básicas, especialmente las hojas, incluyendo vitaminas, carotenoides, polifenoles, ácidos fenólicos, flavonoides, alcaloides, taninos, saponinas y ftalatos16. Los compuestos identificados en la moringa con propiedades nematicidas incluye los flavonoides rutina, luteolina, apigenina, quercetina, y los ácidos fenólicos ácido gálico, ácido elágico, ácido clorogénico, ácido cafeico y ácido rosmarínico17. La quercetina (un flavonoide) y el ácido cafeico (polifenol bioactivo) de forma individual o en acción simultánea, muestran actividad antiparasitaria debido a su efecto sobre la eclosión de los huevos y el desarrollo larvario18. Respecto al control de parasitosis en animales causadas por H. contortus con extractos de M. oleífera existen diversos reportes in vitro, por ejemplo, la actividad antihelmíntica de extractos etanólicos de hojas contra huevos, huevos embrionados y larvas L1 y L2 de H. contortus en cabras19, por citar algunos informes en la literatura científica.
En este estudio se trabajaron diferentes solventes de polaridad creciente, hexano, diclorometano, metanol, alcohol etílico y agua. Debido a la cantidad y eficiencia de extracción en este estudio y en otros similares con alcohol etílico, se optó por utilizar este solvente para el experimento con H. contortus sobre el parasito en diferentes etapas de su ciclo de vida, desde su etapa ovular, larvaria y etapa adulta, probando dosis pequeñas para controlar H. contortus. Este estudio tuvo como objetivo central evaluar el efecto antiparasitario in vitro de extractos de hojas de M. oleífera contra huevos de H. contortus, larvas infectivas L3 y parásitos adultos.
Material y métodos
Recolección de plantas
Se recolectaron hojas de M. oleifera durante el periodo otoño-invierno de 2018 de 50 árboles maduros seleccionados al azar en Cuquio, Jalisco, México (20°55'6" N y 103°01'3'' O) con muestreos a diferentes alturas mezclándolas para obtener una muestra combinada. El estado de madurez se considera como el de mayor concentración de metabolitos según estudios previos sobre esta especie20. Una muestra completa de la planta se llevó al herbario del Departamento de Botánica de la Universidad de Guadalajara para su identificación número de referencia 206,666/IBUG. En relación con las condiciones edafoclimáticas del área de muestreo, esta zona pertenece a la cuenca hidrológica Lerma-Chapala-Santiago y se encuentra en la región centro-noreste de Jalisco a 1,810 msnm; su clima es semiseco, semicálido y con una precipitación anual de 839.5 mm. Los suelos predominantes son planosol éutrico, faozem háplico y luvisol férrico, con bosques naturales compuestos principalmente de robles y pinos21.
Preparación del extracto
Las hojas se secaron a temperatura ambiente de 24 °C a la sombra durante 7 días. Después del secado, las hojas se molieron en un molino (Restsch-GNBH) con una malla de acero No. 60 (abertura de 0.25 mm)22. Trescientos (300) gramos de las hojas molidas se maceraron por triplicado en 1 L de solventes de polaridad creciente: hexano, diclorometano, metanol, alcohol etílico y agua, con agitación (48 h, 28 °C, 150 rpm). Los extractos se filtraron y se concentraron en un evaporador rotatorio (Buchi modelo B-100) a 40 °C bajo presión reducida. Por la cantidad y tipo de compuestos extraídos y con base en reportes previos19,23 se eligió el extracto etanólico para tratar el extracto, por triplicado, obteniendo 3.38 g de extracto peso promedio por cada 300 g de hoja molida, (1.13 %), para efectuar las pruebas antihelmínticas.
Análisis fitoquímico
Se realizó una evaluación cualitativa preliminar de las principales familias de compuestos secundarios mediante tamizaje fitoquímico utilizando técnicas habituales: fenoles, flavonoides, saponinas por el ensayo de espuma, alcaloides por la prueba de Wagner, cumarinas, entre otras22. El contenido de taninos condensados en el extracto etanólico fue evaluado por el método de la vainillina24 expresado como el equivalente de catequina (EC) bs (base seca); fenoles por la técnica de Folin Ciocalteu utilizando ácido gálico como estándar (EAG)25 y flavonoides (técnica AlCl3)26 utilizando catequina como estándar de referencia (EC).
Análisis por espectrometría de masas (MS)
El extracto etanólico crudo se filtró a través de una membrana de diámetro de poro de 0.24 µm, para posteriormente ser analizado en un espectrómetro de masas triple cuadrupolo Agilent modelo 6430 (USA) equipado con una fuente de ionización por electrospray27 en modo negativo (la espectrometría de masas es una identificación preliminar que evalúa la masa-carga (m/z) y la masa molecular de los posibles compuestos contenidos en el extracto). La identificación se realizó comparando las masas de diferentes compuestos reportados en bancos de espectros de masas (https://massbank.eu/MassBank/Search) y se contrastaron contra los reportados en otros estudios de composición de moringa.
Infección de ovinos con larvas de H. contortus
Los ovinos se infectaron con H. contortus de manera controlada para de esta manera obtener parásitos en diferentes etapas de desarrollo. Se seleccionaron al azar tres ovinos Pelibuey, hembras y machos, de 10 meses de edad y con un peso aproximado de 20 kg que fueron alojados en jaulas metabólicas individuales provistas de ventilación, temperatura de 18-20 °C, aplicando un fotoperiodo de 8 h de luz y 16 h de oscuridad con libre acceso a agua. Después de 20 días los animales se desparasitaron con dos antihelmínticos sintéticos comerciales utilizados por su efectividad generalmente del 100 %: levamisol al 12 % con dosis vía subcutánea de 7.5 mg por kg de peso corporal y albendazol con dosis via oral de 5.0 mg por kilo de peso corporal. Una vez libres de parásitos los animales se infectaron con cultivos monoespecíficos de H. contortus donado por la FES-Cuautitlán UNAM, dispensados por sonda esofágica a razón de 300 larvas infecciosas (L3) /kg de peso corporal. Veinte (20) días después se confirmó la infección verificando una carga parasitaria en heces mayor a 3,000 huevos por gramo (hpg) de heces. Las muestras fecales se recolectaron directamente del recto de los animales como se ha descrito en trabajos previos28,29. El diagnóstico parasitológico se basó en el uso de técnicas para evaluar los estadios biológicos presentes mediante gradientes de densidad, fototropismo y termotropismo. El muestreo y conteo de huevecillos y larvas del parásito por gramo requirió de la técnica de Mc Master30 con un factor de multiplicación de 50 y de la técnica de Baermann31, respectivamente, mientras que el parásito adulto se obtuvo directamente del abomaso de los ovinos. Las larvas L3 y los parásitos adultos se caracterizaron taxonómicamente mediante claves de identificación morfométrica32,30.
Prueba de eclosión de huevos (EHT)
Se aplicó el método de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria (WAAVP) de Coles et al., 199233. Los huevos de H. contortus se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, por cuadruplicado, se colocaron 75 huevos/ml (250 huevos/pocillo) en placas de 24 pocillos añadiendo a continuación el extracto etanólico de hojas de moringa como agente antiparasitario a dosis de 0.15, 0.30, 0.60 y 1.20 mg/ml, PBS como control negativo y levamisol al 12 % como control positivo. Las placas se mantuvieron en incubación durante 48 h a 28 °C, después de lo cual se agregó una gota de yodo de lugol para detener el proceso de eclosión. Se registró el número de huevos y larvas con ayuda de un microscopio óptico de campo claro (Primo Star Carl Zeiss) con un aumento de 10x. Para calcular el efecto ovicida se aplicó la siguiente fórmula34:
Obtención de larvas (L3)
Se recogieron muestras fecales separadas por vía rectal y se combinaron en una sola mezcla, se trituraron con un mortero, se agregó agua destilada según fuera necesario y se almacenaron en bolsas plásticas. Se colocaron alícuotas de heces en placas Petri de 10 cm, y éstas, a su vez, se colocaron en placas Petri de 15 cm que contenían un centímetro de agua. Posteriormente, las heces se incubaron a 27 °C (incubadora Felisa ©) durante siete días para obtener larvas L3. El material de cultivo recolectado con un aparato Baerman, se depositó en una bolsa de gasa y se sumergió en agua tibia dentro de un embudo. Las larvas que cayeron al fondo se recolectaron cada 24 h y se centrifugaron durante 4 min a 1,500 rpm31.
Prueba de inhibición de la migración larvaria (LMIT)
La actividad se evaluó en larvas L3. Se aplicó la técnica de Corticelli y Lai35. Se colocaron 150 larvas en movimiento activo en cada uno de los pocillos separados de una placa de 24 pocillos, se agregó el extracto etanólico de M. oleífera en dosis de 0.15, 0.30, 0.60 y 1.20 mg/ml y pH 7.5 por cuadruplicado. Las placas se incubaron a 24 ⁰C durante diferentes períodos de 0, 2, 4 y 6 h después de lo cual se registró la ausencia de motilidad (considerada como actividad antihelmíntica). Se utilizó PBS y levamisol al 12 % como controles negativo y positivo, respectivamente.
Recolección de parásitos adultos
Se sacrificó una oveja hembra con cargas parasitarias mayores a 70,000 hpg aplicando métodos humanitarios sin sufrimiento animal con el consentimiento del comité de bioética del Centro de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara (oficio C. INV./049/2021). Se extirpó el abomaso y se recolectaron parásitos adultos de H. contortus con motilidad activa que se lavaron con una solución de PBS (pH 7.2) para ser utilizados en la prueba28.
Prueba de motilidad de parásitos adultos (AMT)
Esta prueba se utilizó para medir la actividad de los extractos etanólicos sobre lombrices adultas. Se seleccionaron 15-20 lombrices adultas con motilidad activa y se colocaron en cuatro cajas Petri (∅ 74 mm). Se añadió un mililitro de extracto etanólico de M. oleífera a diferentes dosis (0.15, 0.30, 0.60 y 1.20 mg/ml), y se utilizó levamisol al 12 % además de PBS (pH 7.2) como controles positivo y negativo a 27 ⁰C. Después de 0, 2 y 4 h se contaron y registraron los parásitos vivos (móviles) y muertos (inmóviles) en cada concentración utilizando un microscopio estereoscópico (Primo Star Carl Zeiss). El criterio utilizado para considerar un gusano muerto o paralizado fue la falta de motilidad durante 5 a 6 seg luego de tocar intermitentemente al parásito con la punta un estilete28,36.
Diseño experimental y análisis estadístico
El estudio se planteó como un diseño completamente aleatorizado fijando como variables independientes la dosis de extracto etanólico de moringa aplicado (0.15-1.20 mg/ml) y el tiempo de exposición (excepto EHT, que tuvo un tiempo fijo de 48 h). Todos los datos se sometieron a pruebas de normalidad mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov y de homogeneidad de varianzas mediante una prueba de Levene. La comparación de las medias de EHT, LMIT y AMT fue por análisis de varianza (ANOVA) de dos vías utilizando el software SPSS versión 17.0 (SPSS Inc ®). La prueba de significación estadística post hoc empleada fue la diferencia mínima significativa (LSD) con P<0.05. La concentración letal del 50% (CL50) se calculó utilizando las líneas de regresión del probit para un nivel de confianza del 95 %.
Resultados
Análisis fitoquímico
El examen cualitativo preliminar mostró una presencia más evidente de flavonoides y taninos en el extracto etanólico de hojas de moringa que la mostrada por los extractos del resto de los solventes utilizados (acuoso, metanólico, diclorometano, hexánico). Se observó una presencia moderada de alcaloides (test de Wagner) en todos los casos. Se decidió utilizar el extracto de alcohol etílico para su caracterización química y como antihelmíntico debido a que contiene una abundante presencia tanto de flavonoides como de taninos, que son compuestos con propiedades antihelmínticas. El análisis cuantitativo mostró un contenido de fenoles de 3.29 ± 0.54 g EAG/100 gbs, flavonoides 3.06 ± 0.55 g EC/100 gms y taninos condensados 0.37 ± 0.41 g EC/100 gbs. El estudio por medio de espectroscopia de masas del extracto crudo etanólico se muestra en la Figura 1, en la que la señal 7 sería un glucosinolato, la señal 6 sería una flavanona, la señal 10 sería un flavonoide glicosilado, la señal 11 sería una quercetina y la señal 15 sería un flavonol.
Actividad inhibitoria sobre huevos, larvas y lombrices adultas
El efecto de los extractos etanólicos de moringa sobre H. contortus del estudio se muestran en las Figuras 2-4. La Figura 2 se refiere al efecto inhibitorio sobre la eclosión de huevos de H. contortus con efecto ovicida ascendente hasta la dosis de 0.6 mg/ml (93.9 % de efectividad) y más aplanado hasta la dosis de 1.2 mg/ml en el que se registró el dato mayor de eclosión de 97.9 %, con un valor de CL50 de 0.398 mg/ml y nivel de confianza del 95 %. Levamisol (control positivo) inhibió casi por completo la eclosión de huevos con 99.5 % de efectividad. La gráfica también muestra una línea punteada que representa el número de larvas L1 proporcional a la eclosión de los huevos.
La Figura 3 presenta la prueba de movilidad de larvas a diferentes tiempos y dosis (variables experimentales). La contribución de ambos factores mostró valores P˂0.05 (pextractp = 0.0000; ptiempo = 0.0000), lo que revela un efecto significativo sobre el porcentaje de muerte o inhibición del parásito en estado larvario, con un nivel de confianza de 95%. Aunque ambos factores son significativos, el análisis no mostró interacción significativa entre ambos factores debido probablemente a la respuesta no dependiente de la dosis agregada. Debido a que se está probando el efecto de la dosis sobre el parásito, se aplicó la prueba DMS de Fisher para determinar qué valores de las dosis varían significativamente entre sí, en los diferentes tiempos. Las dosis fueron marcadas con letras en tiempos de 2, 4 y 6 h, las que presentan la misma letra no expresan diferencia significativa (P<0.05). En el intervalo probado se observa un efecto inhibitorio irregular al probar diferentes dosis, ya que la máxima inhibición fue
83.3 % con una dosis de 0.3 mg/ml y 6 h de tratamiento, y sin embargo dosis mayores no provocaron mayor inhibición del crecimiento larvario e incluso presentaron valores menores en algunos casos al aplicar dosis mayores.
La Figura 4 muestra la prueba de motilidad de parásitos adultos con 2 y 4 h de exposición. De manera similar que la prueba de inhibición de las larvas, tiempo y dosis fueron estadísticamente significativas con P=0.0000 ambas, sin efectos cruzados, (probablemente por la misma causa indicada, la no dependencia de la dosis aplicada). Las diferencias significativas de las dosis fueron indicadas con letras sobre la Figura 4 con letras en cada uno de los tiempos. Al igual que el efecto sobre larvas L3 se obtuvo una inhibición irregular con relación a las dosis aplicadas: El mayor efecto de 82.1 % AMT fue con 0.15 mg/ml y 4 h y dosis mayores no provocaron mayor mortalidad y en algunos casos disminuyó el efecto parasiticida.
Discusión
La prueba de inhibición de eclosión de huevos (EHT) de H. contortus in vitro al aplicar extracto etanólico de moringa fue positiva registrando un efecto regular dependiente de la dosis y del tiempo. Por el contrario, la inhibición (LMIT) sobre larvas L3 y parásitos adultos (AMT) fue irregular y no dependiente de la dosis a diferencia del control positivo levamisol tuvo una fuerte actividad antihelmíntica sobre larvas y gusano adulto. En un estudio similar con extractos etanólicos y acuosos de hojas de Moringa contra H. contortus19 se probaron cinco concentraciones diferentes con tiempos de tratamiento de 6 h para EHT y 24 h para LMIT sobre larvas L1 y larvas L2. Los mejores resultados fueron 99 ± 2 % con LC50 de 1.74 mg/ml y 98.8 ± 2.5 % para larvas L1 y 100 ± 0 % para larvas L2, ambos a 5 mg/ml con respuesta inhibitoria dependiente de la dosis aplicada. Estos resultados coinciden con los reportados aquí para EHT, pero son mejores contra la migración larvales considerando que se aplicaron mayores dosis en larvas con estado de desarrollo L1 y L2. En otro estudio, Cabardo y Portugaliza23 aplicaron pruebas de EHT con 72 h de tratamiento y LMI en larvas en estado infectivo (L3) con 3 h y cinco diferentes dosis de extractos etanólicos y acuosos (0.95-15.6 mg/ml) de semillas de moringa contra H. contortus. Con dosis semejantes a las aplicadas en este estudio de 0.95 mg/ml encontraron un menor efecto que el aquí fue reportado de 26.7 5% de actividad ovicida y de 31.48 % de actividad larvicida siendo los mejores resultados 95.89 % de actividad ovicida y 56.94 % de actividad larvicida a dosis de 15.6 mg/ml. La prueba LMIT mostró un efecto inhibitorio dosis dependiente contra las larvas parasitarias hasta dosis de 7.8 mg/ml, ya que al aplicar el doble de dosis reporta ligera disminución con un valor de inhibición de 56.11 %. Además36 se evaluó el efecto de seis concentraciones de extractos acuosos de Anogeissus leiocarpus y Daniellia oliveri sobre parásitos adultos de H. contortus el efecto inhibitorio no fue dosis dependiente. De acuerdo con estos resultados, la evidencia indica que se requieren dosis altas de extracto alcohólico para eliminar larvas y parásitos adultos y dosis más bajas para inhibir la eclosión de huevos, además de que los extractos acuosos son menos efectivos que los extractos etanólicos. La actividad ovicida y larvicida es atribuible a los flavonoides, taninos, alcaloides y carbohidratos presentes en las hojas de M. oleifera, que pueden difundirse a través de las cáscaras de los huevos o la cutícula de las larvas o difundirse hacia las células intestinales para causar inhibición o un efecto de mortalidad19.
En la bibliografía se encuentran diversos reportes sobre la composición química de la moringa. Estas familias de metabolitos contienen compuestos con actividad biológica y antihelmíntica como zeatina, quercetina, β-sitosterol, ácido cafeoilquínico, kaempferol, kaempferitrina, isoquercitrina, ramnetina, ramnosa así como glucosinolatos e isotiocianatos37. Asimismo, los extractos etanólicos, etéreos y acuosos de las hojas contienen los taninos catecoles y ácido gálico, así como esteroides, triterpenoides, flavonoides (rutina, luteolina, apigenina y quercetina), saponinas, antraquinonas, alcaloides38, y en especial los compuestos fenólicos niazirina, niazirinina y 4-(4'-O-acetil- alfa-L-ramnosiloxi) bencil isotiocianato que tienen actividad antihelmíntica a través de la parálisis de helmintos17,39. El estudio de espectrometría de masas (MS) del extracto etanólico aplicado en este trabajo (Figura 1) muestra la posible presencia de glucosinolatos, flavanonas y flavonoides, coincidiendo con las familias de los compuestos antihelmínticos más mencionados. Además de las propiedades antihelmínticas, estos compuestos fitoquímicos obtenidos de la moringa y otros vegetales, presentan actividad biológica benéfica antioxidante, anticancerígena, inmunomoduladora, antidiabética, antiaterogénica, hepatoprotectora y de regulación del estado tiroideo40. Tales propiedades permitirían un control biológico antihelmíntico seguro y sostenible proveniente de plantas principalmente medicinales41 para reemplazar progresivamente los menos inocuos fármacos antihelmínticos sintéticos. No obstante, se deben resolver varios inconvenientes como, por ejemplo, encontrar las condiciones y dosis adecuadas al aplicar extractos naturales para vencer la barrera de la cutícula de los parásitos (la cual los envuelve, protege, da forma a los parásitos y está involucrada en la motilidad y los intercambios metabólicos de los parásitos42, y de esta manera inmovilizarlos o eliminarlos. Se menciona que la actividad antihelmíntica sinérgica de los compuestos activos de las plantas (taninos, flavonoides y saponinas, principalmente) podrían alterar la forma de los poros y la permeabilidad de la cutícula, para facilitar la difusión de los compuestos y aumentar la exposición del nematodo43. Los taninos y flavonoides inhiben la secreción de enzimas, lo que causa la inestabilidad y desorganización de las células neuronales, los músculos y la energía metabólica que conducen a alteraciones en la flexibilidad, parálisis y eventualmente la muerte44.
En este estudio la eclosión de huevos (EHT) fue dosis dependiente mientras que la inhibición de la migración larvaria (LMIT) y la motilidad adulta (AMT) fueron no dosis dependientes con una respuesta irregular. Este comportamiento se ha presentado en algunos reportes de pruebas in vitro con extractos naturales sobre larvas desarrolladas o en estado adulto37,45. La dosis aquí probada de 1.2 mg/ml mostró efecto ovicida, pero no larvicida o vermicida. factible a dosis mayores, hasta un máximo de 7.8 mg/ml23 para un mejor control de larvas y parásitos adultos. Como ya se mencionó las larvas L3 y los parásitos en etapa adulta presentan una cutícula protectora desarrollada y mecanismos de defensa más consolidados46 por lo que su respuesta a los compuestos naturales sería diferente si se compara al efecto de los fármacos sintéticos más agresivos. Se ha mencionado que las larvas L3 y los parásitos adultos podrían desarrollar rápidamente resistencia a los compuestos activos de las plantas a través de complejos mecanismos de defensa en la cutícula, una matriz abundante en colágeno, que actúa como exoesqueleto y se sintetiza en la epidermis o hipodermis del parásito modificando la absorción del extracto a nivel de membrana47, superando o contrarrestando los efectos de los componentes activos, los cuales además algunas veces son inestables en ciertas condiciones de pH o temperatura entre otros factores, y podrían degradarse debido a su naturaleza, lo que ocasionaría una menor efectividad contra parásitos L3 o parásitos adultos48. El efecto inhibitorio alcanzó un máximo y luego la tendencia a la baja a pesar del aumento en la concentración de los extractos en esta zona de estudio, lo que posiblemente se evitaría aplicando dosis mayores de extractos naturales. Es importante establecer la composición y la dosis correcta que aniquile los parásitos para evitar el desarrollo de resistencia46.
Conclusiones e implicaciones
Los metabolitos de las hojas de moringa como flavonoides, fenoles, ácidos fenólicos, taninos, entre otros, que poseen actividad antihelmíntica y propiedades biológicas benéficas para la salud del ser humano, también podrían ser utilizados como alimento para animales. En este trabajo se aplicaron tres pruebas in vitro para medir el efecto inhibitorio sobre H. contortus en tres diferentes estadios de vida. Dosis bajas de 1.2 mg/ml pueden causar un efecto inhibitorio al suprimir la apertura de los huevos que podrían romperse o interrumpir el ciclo de vida del parásito en esta etapa. Sin embargo, esta dosificación (baja) no fue efectiva contra larvas o parásitos adultos, en cuyo caso son necesarias dosis mayores para una acción letal más efectiva, por lo que se recomienda, producto de este estudio y otros similares, aplicar dosis mayores, que otros estudios especifican de máximo 7.8 mg/mL, para lograr una inhibición más efectiva, dosis dependiente y controlada del parasito en su fase larvaria y adulta.
Financiamiento
Este proyecto no recibió apoyo financiero externo.