Introducción
La región de Los Llanos, en Durango, México, es relevante en la producción de frijol (Phaseolus vulgaris), cultivo fundamental para la economía y la seguridad alimentaria local1. Este residuo agroindustrial se emplea frecuentemente como una fuente de alimentación del ganado; no obstante, su alto contenido de componentes de la pared celular (celulosa, hemicelulosa y lignina), y su bajo contenido de proteína cruda limitan su aprovechamiento, lo que justifica explorar la microbiota nativa como alternativa para mejorar su valor nutricional2. La sostenibilidad de estos sistemas agrícolas se ve amenazada por la dependencia de insumos químicos para el manejo de plagas y enfermedades, lo que contribuye al deterioro ambiental y limita la resiliencia de los productores ante los retos del cambio climático y la variabilidad de los mercados. En consecuencia, se requieren modelos agrícolas más sostenibles, innovadores y adaptados a las condiciones locales.
En este contexto, la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) recomienda reorientar las políticas agrícolas hacia prácticas que beneficien al medio ambiente y promuevan el uso sostenible de los recursos naturales, donde destaca el aprovechamiento de la biodiversidad nativa como una vía estratégica3. El aislamiento y estudio de microorganismos autóctonos, como los hongos asociados a la paja de frijol, representa una posible alternativa para el desarrollo de bioinsumos y la producción de enzimas con aplicaciones biotecnológicas.
El descubrimiento y bioprospección de hongos en agroecosistemas subraya la importancia de conservar la diversidad biológica local, ya que estos organismos pueden ser fuente de metabolitos y enzimas de alto valor para la agricultura, la industria y la salud. Integrar a estos avances científicos en las cadenas productivas regionales puede fortalecer la competitividad, generar nuevas oportunidades económicas y promover la inclusión social, en línea con los principios de sostenibilidad, innovación y equidad impulsados por la OCDE.
El objetivo de esta investigación fue aislar, identificar y evaluar la bioprospección de hongos nativos de la paja de frijol (Phaseolus vulgaris) con énfasis en su potencial para producir enzimas de interés biotecnológico. Este enfoque busca contribuir al desarrollo de prácticas agrícolas más sostenibles y resilientes en Durango, promover la conservación de la biodiversidad y el desarrollo regional, alineándose con recomendaciones internacionales para el sector agroalimentario.
Material y métodos
Obtención de materia prima
Se recolectó paja de frijol variedad Pinto saltillo en el predio Santa Catalina de Siena (Latitud: 24. 58º Longitud: -104.09º). En Guadalupe Victoria. Durango, México. durante el período comprendido de otoño a invierno del año 2023.
Aislamiento de hongos
Se utilizaron 30 g de paja de frijol molida (tamaño de partícula de 8 mm). Cada muestra se colocó en matraces con capacidad de 100 ml con humedad de 65 % e incubación a temperatura ambiente en obscuridad durante 10 días. Posteriormente, se tomó una fracción de la paja con al menos una colonia y se inoculó en Agar Papa Dextrosa (PDA) con 1% de ampicilina como antibiótico. Las placas se incubaron a 28 °C durante 72 h. Se realizaron resiembras periódicas en el mismo medio hasta tener las cepas puras.
Identificación morfológica macro y microscópica de hongos
Se identificaron macroscópica y microscópica seis cepas (Figura 1) de acuerdo con la metodología propuesta por Ríos-Ruiz4, Se empleó un microscopio óptico LEICA DM750® con cámara LEICA ICC50HD® (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las características macroscópicas evaluadas fueron color de cepa, forma, contorno, textura, tipo de crecimiento y área de crecimiento, comparadas con el Royal Botanic Garden Edimburg (Real Jardín Botánico de Edimburgo, Escocia, Reino Unido)5.
Actividad celulítica
La actividad celulolítica se determinó con la técnica rojo Congo6. A partir de las cepas conservadas en PDA, se obtuvo una solución de esporas a las 96 h de crecimiento. Se colocaron 50 µl en un orificio de 6 mm de diámetro en el medio Carboximetil celulosa (CMC); se incubaron a 30 °C por 48 h. Se tiño el medio con 5 ml de rojo Congo al 1% por 15 min; se retiró el exceso y se lavó con 5 ml de solución de NaCl 2M por 15 min. La actividad celulolítica se determinó por halos de degradación de celulosa (mm).
Identificación molecular
La extracción de ADN genómico se realizó con kits comerciales InstaGene Matrix (BIO-RAD) y MG Tissue SV (Doctor Protein INC, Corea). Se emplearon los oligos ITS5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC). Las amplificaciones por PCR se realizaron con Axen™️ H Taq PCR Máster Mix (2X) (Roche), bajo condiciones: 95 °C por 5 min, 35 ciclos de 95 °C/30 seg, 52 °C/30 seg,72 °C/1 min; y extensión final de 72 °C por 10 min, en termociclador DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD). Los productos se purificaron mediante placa de filtro Multiscreen (Millipore). La secuenciación se efectúo con BigDry Terminator v3.1 y Secuenciador ABI PRISM 3730XL (96 capilars), en el Laboratorio de Servicios Genómicos de Macrogen, Seúl, República de Corea. El análisis de variantes se realizó con Varianr Report c2.1 ( Applied Biosystems), complementando con DNASTAR Lasergene SeqMan 7.0 y el programa de análisis SNP de Macrogen v1.0. Las secuencias se analizaron y compararon con otras secuencias utilizando BioEdit7, la base de datos del National Center Biotechnology Information (NCBI) mediante la herramienta BLAST8 y el software MEGA 7®9.
La historia evolutiva se obtuvo con Máxima Verosimilitud bajo el modelo de dos parámetros de Tamura y Nei9. Se presenta el árbol con la mayor probabilidad logarítmica (-1933,53), junto con el porcentaje de agrupación de los taxones en las ramas. Para la búsqueda heurística, generó árboles iniciales mediante los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ, aplicados a matrices de distancias por pares con el enfoque de Máxima Verosimilitud Compuesta (MCL). Se eligió la topología con mayor probabilidad logarítmica. Se modelaron variantes en tasas evolutivas entre sitios con distribución Gamma discreta ( cinco categorías; +G, parámetro= 0,2211))(10). Las secuencias fueron depositadas en la base de datos GenBank del NCBI.
Evaluación de la actividad enzimática
Se tomó un disco (5 mm de diámetro, 24 h de incubación) por hongo aislado y se sembró en placas de agar con el medio descrito por Córdova-Albores et al10. Para cada cepa, se inocularon dos placas de cada medio con diferentes fuentes de carbono. El índice de potencia (IP) se calculó dividiendo el diámetro del halo de hidrólisis por el diámetro de crecimiento micelial2 Las determinaciones se hicieron por triplicado.
Determinación de actividad enzimática e índice de potencia
Amilasa (EC 3.2.1.1). Fuente de carbono: 20 % de almidón (medio Castañeda-almidón), tras la incubación por 72 h a 28 °C, las placas se inundaron con yodo por 15 min (Corporación Sigma-Aldrich). Se detectó la actividad como halo transparente.
ATPasa (EC 3.6.5). Fuente de carbono: 5 % de glucosa (medio Alkeksandrow + azul de bromofenol). Tras la incubación por 72 h a 28 °C, las placas se inundaron con yodo por 15 min (Corporación Sigma-Aldrich). Se detectó actividad como halo transparente.
Celulasa (EC. 3.2.1.4). Fuente de carbono:1 % de carboximetilcelulosa (CMC). Tinción con rojo Congo, tras la incubación por 4 h a 28 °C. La actividad se detectó como un halo amarillo alrededor del micelio.
Esterasas (EC 3.1.1). Fuente de carbono: 10 % de peptona (medio Tween 80). Tras la incubación por 72 h a 28 °C, se detectó actividad como halo con aspecto graso y tonalidad tornasol.
Fosfatasa (EC 3.1.3). Fuente de carbono: 10 % de glucosa, (medio NBRIP + azul de bromofenol. Tras la incubación por 72 h a 28 °C, las placas se inundaron con yodo por 15 min (Corporación Sigma-Aldrich). Se detectó actividad como halo transparente.
Lignina manganeso peroxidasa (EC 1.11.1.14). Fuente de carbono: 5 % de peptona (medios de lignina (lactasa, manganeso peroxidasa, peroxidasa). Tras la incubación por 96 h a 28 °C, las placas se inundaron con yodo por 15 min (Corporación Sigma-Aldrich). Se detectó actividad como halo transparente.
Lipasa (EC 3.1.1). Fuente de carbono: 10 % de peptona, (medio Tween 20). Tras la incubación por 72 h a 28 °C, se detectó actividad como halo con aspecto graso y tonalidad tornasol.
Nitrogenasa (EC 1.18.6.1). Fuente de carbono: 10 % de glucosa (medio Winodradsky libre de nitrógeno: medio mínimo (MM) + (azul de bromotimol). Tras la incubación durante 72 h a 28 °C, las placas se inundaron con yodo por 15 min (Corporación Sigma-Aldrich). Se detectó actividad como halo transparente.
Pectinasa (EC 3.2.1.8). Fuente de carbono: 20 % de almidón (medio Castañeda-pectina) Tras la incubación por 72 h a 28 °C, las placas se inundaron con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) al 5 % por 20 min. Se detectó actividad como halo transparente.
Proteasa (EC 3.4.21). Fuente de carbono: 10 % de triptona (medio Luria-Bertani (LB)-leche). Tras la incubación por 72 h a 28 °C, se detectó actividad como halo de color pardo.
Sideróforos/Quitinasa (EC 3.2.1.15). Fuente de carbono: 20 % de almidón, (medio cromo azurol (CAS). Tras la incubación por 72 h a 28 °C, se detectó actividad como halo de color amarillo.
Triptofanasa (EC 4.1.99.2). Fuente de carbono: 30 % de glucosa, (medio agar papa dextrosa (PDA) + triptófano). Tras la incubación por 96 h a 28 °C, las placas se inundaron con solución Saukowski por 30 min en completa oscuridad. Se detectó actividad como halo de color marrón11,12.
Análisis estadístico
Los valores de PI (índice de potencia) y las actividades enzimáticas se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) de un factor y prueba de Tukey para la comparación de medias, utilizando el software Minitab, LLC® (2019).
Resultados
Aislamiento
Se obtuvieron seis cepas de hongos filamentosos: dos Aspergillus spp. (RC1 y RC4), tres Clonostachys spp. (RC2, RC5 y RC7) y uno del género Mucor spp. (RC8), por su carácter patógeno, se descartó la caracterización de Mucor; asimismo, se excluyeron las cepas de Aspergillus spp., por su posible patogenicidad. La identificación confirmó la pertenencia de las cepas restantes al género Clonostachys, reconocido por su potencial como agente de control biológico contra hongos fitopatógenos en plantas, mediante competencia por nutrientes y espacio, micoparasitismo y antibiosis por la producción de metabolitos secundarios que inducen resistencia en las plantas. Estos mecanismos permiten a Clonostachys controlar poblaciones de hongos patógenos y proteger las plantas de daños significativos. El aislamiento y caracterización de cepas de Clonostachys se perfila como una alternativa factible para desarrollar estrategias de control biológico sostenible y eficaz en la protección de cultivos y ecosistemas13.
Actividad celulolítica
Los índices de crecimiento y los halos de degradación de celulosa se analizaron para comparar el desempeño de las diferentes colonias fúngicas. El análisis estadístico reveló diferencias significativas entre los hongos tanto en el índice de crecimiento como en el diámetro de los halos de degradación, lo que confirma la variabilidad funcional entre las cepas y facilita la selección de los aislados con mejor potencial en la degradación de celulosa.
El índice de potencia se presenta en la Figura 2, donde el IP mostró diferencias significativas entre las cepas evaluadas (ANOVA, P<0.05). La prueba de Tukey confirmó mayor capacidad celulolítica en las cepas de Clonostachys respecto de Aspergillus. La cepa RC5 presentó el valor más alto (2.60a), seguida por RC2 con (2.05a), ambas superiores a las cepas de Aspergillus RC1 (1.36b) y RC4 (1.27b). Estos resultados posicionan a Clonostachys RC5 y RC2 como aislados con mejor desempeño en degradación de celulosa. Las cepas de Clonostachys spp., exhibieron potencial para degradar pared celular del forraje y controlar hongos responsables del deterioro postcosecha de frutos y verdura lo cual contribuye a la inocuidad alimentaria13.
Actividad enzimática e Índice de potencia
En la Figura 3 presenta los datos relevantes de la evaluación enzimática de las tres cepas de Clonostachys que se caracterizaron por su capacidad de producir y secretar. El análisis de la actividad enzimática mostró diferencias significativas entre las cepas evaluadas (P<0.05). Las medias ± desviación estándar reflejaron variabilidad controlada; mientras que la prueba de Tukey distinguió el desempeño de cada aislado. Las cepas RC5 y RC7 registraron las mayores actividades en la mayoría de las enzimas hidrolíticas y oxidativas, en tanto que la cepa RC2 destacó en fosfatasa y pectinasa. No se observaron diferencias en la actividad proteásica. En conjunto, se evidencia diversidad funcional que posiciona a los aislados RC5 y RC7 como las cepas con mayor potencial biotecnológico bajo las condiciones evaluadas. Estos resultados proporcionan información valiosa para optimizar y desarrollar nuevas aplicaciones biotecnológicas.
El análisis de la actividad enzimática de las cepas nativas de Clonostachys spp. (RC2, RC5 y RC7) mediante la evaluación estadística de ANOVA de una vía, evidenció diferencias significativas (P<0.05) en varias de las enzimas analizadas.
Para la actividad amilasa, RC5 mostró la mayor producción, superior a RC2, mientras que RC7 presentó un valor intermedio. En celulasa, RC5 fue la más destacada, superando a RC2 y RC7. En fosfatasa, RC2 registró la mayor actividad. En enzimas oxidativas, RC7 presentó los valores más altos en lignina manganeso peroxidasa, seguida de RC5 y RC2; la actividad lipasa mantuvo el mismo patrón. En pectinasa, RC7 mostró la menor actividad; RC2 y RC5 no difirieron entre sí. En proteasa, no hubo diferencias significativas. En sideróforos/quitinasa, RC7 fue la más activa, superando a RC2 y RC5. En triptofanasa, RC7 presentó mayor producción, seguida de RC5 y RC2, todas distintas estadísticamente.
Estos resultados subrayan variabilidad funcional entre las cepas nativas de Clonostachys spp., con potencial para aplicaciones biotecnológicas orientadas a la agricultura y a la industria. En particular, RC7 mostró un perfil enzimático sobresaliente en actividades clave como lignina manganeso peroxidasa, lipasa, sideróforo-quitinasa y triptofanasa posicionándola como una candidata idónea para futuros desarrollos de bioinsumos. La diversidad funcional observada refuerza la relevancia de la bioprospección microbiana en agroecosistemas, en línea con las recomendaciones de la OCDE para el aprovechamiento sostenible de la biodiversidad y la innovación en sectores estratégicos como la agricultura.
Identificación molecular y filogenia
El análisis molecular identificó tres cepas del género Clonostachys a partir de la paja de frijol (Phaseolus vulgaris). Las secuencias mostraron valores adecuados de similitud y cobertura. En la filogenia, las tres cepas formaron un clado bien definido, respaldando su separación respecto de otras especies del género (Figura 4), donde las cepas muestran relación cercana con Clonostachys kunmingensis. Esta agrupación sugiere la presencia de linajes no registrados previamente en el material evaluado. Los datos generados constituyen una referencia sólida sobre la diversidad de Clonostachys asociada a la paja de frijol bajo las condiciones del presente estudio.
Discusión
El aislamiento y caracterización de hongos del género Clonostachys a partir de paja de frijol contribuye a la comprensión ecológica de estos hongos, y abre nuevas vías para el desarrollo de métodos biológicos en el control de fitopatógenos, como se ha reportado para Clonostachys rosea en control biológico y biorremediación11. Se ha informado que Clonostachys rosea inhibe el crecimiento de los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea14. Las especies de Clonostachys ocupan diversos hábitats, lo que evidencia su adaptabilidad a diferentes condiciones ambientales. La ausencia de reportes sobre su aislamiento en paja de frijol sugiere un nuevo nicho ecológico poco explorado; otros autores han aislado el género de otros sustratos como es el caso de suelo, hojas muertas y madera12-17 subrayando la importancia del ambiente edáfico y detritos vegetales para su desarrollo.
Las tres cepas fueron identificadas a nivel de género. La región utilizada (complejo ARN ribosomal 18 S, 5,8 S y 28 S) es la más común para identificar ADN fúngico. Los análisis filogenéticos con ITS sugieren la probable existencia de nuevas especies: sin embargo, dada la complejidad morfológica del género Clonostachys se sugiere complementar con genes RPB2, LSU, TEF2 y TUB2 para precisar a delimitación taxonomía.
En este estudio, el análisis de secuencias del gen ITS, permitió una identificación precisa a nivel de género. Se evaluó el potencial biotecnológico de nueve enzimas extracelulares sintetizadas por hongos aislados de la paja de frijol. El diseño experimental se aplicó con rigor; el índice de potencia y las actividades enzimáticas se analizaron mediante ANOVA de un factor y la prueba de Tukey, empleando Minitab, LLC® (2019). Se verificó los supuestos de normalidad, homogeneidad de varianzas e independencia. En el género Clonostachys, se observó capacidad para producir amilasa, celulasa, fosfatasa, lignina manganeso peroxidasa, lipasa, pectinasa, proteasa, sideróforos/quitinasa y triptófanasa, la variabilidad entre cepas coincide con lo reportado por Figueroa-Ceballos et al18 sobre la producción de amilasas entre hongos anamorfos aislados de hojarasca; de manera similar, los contrastes observados en este estudio reflejan el potencial metabólico distintivo de cada aislado y confirman la importancia de explorar microorganismos nativos como fuente de enzimas con interés biotecnológico18. Las amilasas tienen múltiples aplicaciones en la industria alimentaria: (cervezas y pan). Su capacidad para degradar almidones las hace útiles en formulaciones de limpieza para la producción de detergentes y facilitan la conversión de biomasa en azúcares fermentables para la producción de bioetanol. Clonostachys spp produce diferentes tipos de celulasa (endo, exo y celobiosas) que actúan en conjunto para descomponer la celulosa en azúcares simples, necesarias en la bioconversión de biomasa, mejora de procesos alimentarios y tratamiento de residuos agroindustriales y con relación a lo reportado, estos hongos tienen gran potencial de aplicación, así como lo mencionado por Gutiérrez et al19.
Las fosfatasas en Clonostachys (p.ej-. RC7), facilitan la disponibilidad de fosfato y se relacionan con propagación de cultivos. Estas enzimas son esenciales para la regulación del metabolismo celular y la señalización, actúan sobre sustratos que contienen grupos fosfato, facilitan la disponibilidad en el medio, en este caso, por ser un aislado de la paja existe concordancia por lo reportado por Diaz et al20. Por otro lado, la lignina manganeso peroxidasa producida por Clonostachys spp es crucial para la degradación de lignina, un componente estructural en las paredes celulares vegetales. Esta enzima cataliza la oxidación del manganeso utilizando peróxido de hidrógeno como cofactor, lo que permite descomponer compuestos fenólicos en la lignina. En el caso de lignina manganeso peroxidasa se produjo en la paja de frijol por el hongo Clonostachys spp. RC5 se puede atribuir a las condiciones bioquímicas de la paja para la producción de fenoles21. Por otro lado, el hongo RC2 exhibió mayor actividad lipasa por lo que, se puede considerar que para el proceso de mejoramiento de la paja de frijol son efectivas en la descomposición de lípidos, al catalizar la hidrólisis de triacilgliceroles; estas enzimas se han reportado que mejoran la digestibilidad y sabor en productos lácteos22. La pectinasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosídicos en la pectina, un polisacárido presente en la pared celular de las plantas. Esta enzima es esencial en diversas aplicaciones industriales, especialmente en la industria alimentaria, donde se utiliza para mejorar la textura y la claridad de los jugos y otros productos derivados de frutas, como es el caso de las cepas RC2 y RC5 que mostraron la mayor producción de pectinasa, enzima responsable de la hidrólisis de los enlaces glicosídicos de la pectina como lo mencionan Haile y Ayele23.
La proteasa es una enzima fundamental en diversos procesos biológicos, incluyendo la digestión, el reciclaje de proteínas y la regulación de funciones celulares. El sideróforo quitinasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de la quitina, un polisacárido estructural que se encuentra en las paredes celulares de los hongos y en los exoesqueletos de los artrópodos. Esta enzima es esencial para la degradación de la quitina, liberando productos como N-acetilglucosamina, que tienen aplicaciones en diversas industrias. Clonostachys spp., ha demostrado ser un productor eficaz de esta enzima, lo que lo convierte en un organismo de interés para la biotecnología. Clonostachys spp. produce triptofanasa en condiciones específicas que favorecen su actividad enzimática. La producción de esta enzima puede ser influenciada por factores como el tipo de sustrato, el pH y la temperatura. Los sustratos ricos en triptófano, como ciertos residuos agrícolas, pueden ser utilizados para optimizar la producción de triptofanasa, lo que no solo mejora la eficiencia del proceso, sino que también contribuye a la sostenibilidad y aprovechar de manera circular los residuos agroindustriales, como la paja de frijol.
La evaluación de este potencial biotecnológico de las cepas de Clonostachys, permite considerar su aplicación como un agente de producción de metabolitos secundarios, control biológico efectivo y tener aplicaciones en la bioconversión de forrajes secos. Hasta el momento, no existen reportes de esta aplicación para este género, únicamente han sido evaluados como agente de biocontrol16 y de biorremediación de suelos19. Existen estudios sobre bioprospección de microorganismos nativos en otros sustratos como es el caso de la candelilla2; sin embargo, la bioprospección de cepas nativas asociadas a la paja de frijol es una contribución de este estudio, aportando una nueva aplicación para el género Clonostachys.
Conclusiones e implicaciones
La bioprospección de cepas nativas aisladas de paja de frijol evidenció avances con relevancia regional y proyección global. La identificación de posibles nuevas especies de Clonostachys y su capacidad para inhibir fitopatógenos como Fusarium oxysporum confirma su potencial como agente de biocontrol, alineado con principios de innovación responsable y con impacto en la seguridad alimentaria (ODS 2). La producción de enzimas extracelulares, incluidas amilasas, celulasas y lignina manganeso peroxidasa, posiciona estas cepas como recursos estratégicos para la bioeconomía circular (ODS 9 y 12), al transformar residuos agrícolas en insumos de valor agregado. Su capacidad para degradar celulosa y lignina amplía sus aplicaciones en biorremediación de suelos (ODS 15) y reduce la dependencia de insumos químicos sintéticos. En el ámbito agrícola, su implementación podría disminuir el uso de fungicidas y fortalecer sistemas productivos sostenibles. Asimismo, la valorización de la paja de frijol permitiría mitigar emisiones de gases de efecto invernadero y generar valor económico a partir de residuos. Se requieren incentivos y marcos regulatorios que faciliten la adopción de bioinsumos y la transferencia tecnológica, además de profundizar en caracterización funcional.